Vad är Western Blot protokoll?

Western blot-protokollet är den exakta normer som immunoblot provningen utförs. Western blot används för att detektera proteiner i ett vävnadsprov. Processen skiljer infödda proteiner genom att bestämma längden av polypeptider med en gelelektrofores. Proteinerna själva sedan överförs till ett nitrocellulosa membran och sökt efter antikroppar. Den första delen av Western Blot protokoll börjar med vävnad samling. Dessa prover har hämtats antingen från levande vävnad eller från en cellkultur. Vävnad bryts ned och olika hämmare såsom proteashämmare eller fosfataser införs för att förhindra enzymer från nedbrytning. Denna del av protokollet som vanligtvis hanteras i kyla för att bevara vävnaderna. Den gelelektrofores processen är nästa steg i Western Blot protokoll. I denna del är de proteiner identifieras av olika faktorer såsom molekylvikt eller elektrisk laddning. Denna process är oftast kompletteras med polyakrylamidgeler med en buffert natriumdodecylsulfat. I princip blir de proteiner negativt laddade och gå mot ett positivt laddade elektroden i gelen.

Överföring av de proteiner som är nästa del av den övergripande Western Blot process. Ett membran är placerad ovanpå gelen, följt av filterpapper. Som en elektrisk ström administreras, är proteiner dras in i membranet. Detta kallas för den faktiska "analys" del av analysen. Membranen är mycket ömtåliga och lätt kan skadas. Den korrekta flöde Western Blot protokoll efterlyser steget kallas bindande. För att undvika kontaminering av proteiner sig av antikroppar som behöver läggas till, ett slags avskärmning behöver genomföras. Den vanligaste typen av blockering använder fettfri torrmjölk och rengöringsmedel. Detta binder till öppna platser i membranet och möjliggör tydligare resultat när antikroppen tillsätts.

Detection är nästa steg efter att rätta till protokollet. De proteiner införs för att antikroppar som har kopplats till ett specifikt enzym som kommer att ge forskarna den önskade informationen. Antikroppen inkuberas med membranet i 30 minuter eller mer. Efteråt är membranet tvättas och en sekundär antikropp införs som binder till den första. Ofta beror det på ett lysande agent används för att bistå forskare med identifieringen.

Materialet tvättas igen för att avlägsna obundet objekt. Analys av storleken på de färgade banden avslöjar information om den betydelse och omfattningen av ett specifikt protein. Detta är vanligtvis avslutad några gånger för att säkerställa en korrekt analys. Alternativ för upptäckt omfatta röntgenstrålar, färg och kemikalier.


Kommentarer

  • Om oss
  • Reklam
  • Kontakta redaktören
  • Få nyhetsbrev
  • RSS-feed

Redaktör: Beáta Megyesi
Nyheter redaktör: Christiane Schaefer

Kundservice: Mats Schaefer,
Helena Löthman

Tel: +46 00 79 22 00
Fax: +46 00 79 22 01

© Copyright 2014 Debok.net - All rights reserved.